非拮抗阻害ではIC50 = Ki

先日の文献セミナーで酵素阻害剤の阻害様式とIC₅₀とK_iの関係についてよく分かっていなくて、頓珍漢な質問をしてしまったのでメモ。

まとめ（引用）

まず結論を引用します。

IC₅₀とK_i値の関係は、in vitroの試験では [S] >> K_mが成立するので、非拮抗阻害や不拮抗阻害ではIC₅₀ = K_iであり、拮抗阻害ではK_i = IC₅₀/(1 + [S]/K_m) からK_i値が換算される（K_m: ミカエリス定数、K_i: 阻害定数）
— 安達ら、2010

ただし、in vitroの試験で常に \([S]\gg K_{\mathrm m}\) が成り立つわけではなく、基質濃度は実験条件に依存します。純粋な非拮抗阻害では、阻害剤の結合による遊離濃度の低下を無視できる条件下で、基質濃度によらず \(\mathrm{IC}_{50}\simeq K_{\mathrm i}\) が成り立ちます。一方、不拮抗阻害では、さらに \([S]\gg K_{\mathrm m}\) の条件が満たされると、\(\mathrm{IC}_{50}\) は阻害剤のESに対する解離定数に近づきます。本記事では、この解離定数を \(\alpha K_{\mathrm i}\) と表します。

なお、後述するtight-binding条件では、純粋な非拮抗阻害でも、総阻害剤濃度としての \(\mathrm{IC}_{50}\) は \(K_{\mathrm i}\) と一致しません。

解説

解説と画像はBuker, S. M., et al., Enzyme–Inhibitor Interactions and a Simple, Rapid Method for Determining Inhibition Modality. SLAS Discovery 2019, 24, 515–522からの引用です。

各阻害様式の定義（純粋型）

• （純粋な）拮抗阻害（competitive inhibition; 競合阻害/競争阻害）では、阻害剤 I は E にのみ結合する。
• 非拮抗阻害（non-competitive inhibition; 非競合阻害/非競争阻害）では、阻害剤 I は E にも ES にも同じ親和性で結合する。
• （純粋な）不拮抗阻害（uncompetitive inhibition; 不競合阻害/不競争阻害）では、阻害剤 I は ES にのみ結合する。

IC₅₀とK_iの一般式

50%阻害濃度IC₅₀と阻害定数K_iの関係は以下の近似式（式1）で表わされます。

\[ {\mathrm{IC}}_{50} = \frac{[S]_0 + K_{\mathrm m}}{\frac{K_{\mathrm m}}{K_{\mathrm i}} + \frac{[S]_0}{\alpha K_{\mathrm i}}} \;\;\;\mbox{・・・式1}\]

式1において、\([S]_0\) は基質の初期濃度を表わします: \([S]_0 = [S] + [ES] + [ESI] + [P] \)。

この式は混合型阻害（mixed-type inhibition; K_i ≠ αK_i）に対するCheng–Prusoff式（Cheng and Prusoff, 1973のCase II）と同一です。阻害様式を解析する目的で、IC₅₀を [S]₀/K_mに対してプロットしたいので、式1を変形すると次のようになります。 $$ {\mathrm{IC}}_{50} = \frac{1 + \frac{[S]_0}{K_{\mathrm m}}}{\frac{1}{K_{\mathrm i}} + \left(\frac{1}{\alpha K_{\mathrm i}} \times \frac{[S]_0}{K_{\mathrm m}}\right)} $$

各阻害様式での極限

拮抗阻害（\(\alpha\to \infty\)）

$$ {\mathrm{IC}}_{50} = \frac{1 + \frac{[S]}{K_{\mathrm m}}}{\frac{1}{K_{\mathrm i}}} = K_{\mathrm i} \left(1 + \frac{[S]}{K_{\mathrm m}}\right)$$

非拮抗阻害（\(\alpha = 1\)）

$$ {\mathrm{IC}}_{50} = K_{\mathrm i}$$

不拮抗阻害（\(K_{\mathrm i}\to \infty\)、ただし\( \alpha K_{\mathrm i}\) が有限の場合）

$$ {\mathrm{IC}}_{50} = \alpha K_{\mathrm i} \left(1 + \frac{K_{\mathrm m}}{[S]}\right)$$

特に\([S] \gg K_{\mathrm m}\)の条件下では、

$$ \mathrm{IC}_{50} \sim \alpha K_{\mathrm i} $$

まとめの表:

阻害機構	パラメータ	IC50
拮抗（competitive）	\(\alpha\to \infty \)	\( K_{\mathrm i} \left(1 + \frac{[S]}{K_{\mathrm m}}\right)\)
非拮抗（non-competitive）	\( \alpha = 1 \)	\( K_{\mathrm i}\)
不拮抗（uncompetitive）	\(K_{\mathrm i}\to \infty\)、\( \alpha K_{\mathrm i} \ll K_{\mathrm i}\)	\( \alpha K_{\mathrm i} \left(1 + \frac{K_{\mathrm m}}{[S]}\right)\)
混合（mixed）	–	\( \frac{[S] + K_{\mathrm m}}{\frac{K_{\mathrm m}}{K_{\mathrm i}} + \frac{[S]}{\alpha K_{\mathrm i}}} \)

それぞれの阻害様式について、 [S]/K_mに対してIC₅₀をプロットしたものが以下の図です。

セミナーで紹介された論文ではこのプロットが “Cheng–Prusoff plot” と呼ばれていました。

式1の導出

導出はCheng and Prusoff, 1973のCase IIから。

ここでは、基質の結合・解離が触媒反応より十分速いとする迅速平衡近似を用います。反応系\[E+S \mathrel{\mathop{\rightleftharpoons}^{k_1}_{k{-1}}} ES \xrightarrow{k_{\mathrm{cat}}}E+P\]について、基質の解離定数 \(K_{\mathrm s}\) とミカエリス定数 \(K_{\mathrm m}\) は、それぞれ\[K_{\mathrm s}=\frac{k_{-1}}{k_1},\qquad K_{\mathrm m}=\frac{k_{-1}+k_{\mathrm{cat}}}{k_1} =K_{\mathrm s}+\frac{k_{\mathrm{cat}}}{k_1}\]と定義されます。したがって、\(k_{-1}\gg k_{\mathrm{cat}}\) の場合には、\(K_{\mathrm m}\simeq K_{\mathrm s}\) と近似できます。

阻害剤の結合についても平衡として扱えると仮定し、EIおよびESIは生成物を生じないものとします。

定義式

$$ K_{\mathrm{m}} \sim K_{\mathrm{s}} = \frac{[E][S]}{[ES]} \;\;\;\mbox{・・・式2}$$

$$ K_{\mathrm{i}} = \frac{[E][I]}{[EI]} \;\;\;\mbox{・・・式3}$$

$$ \alpha K_{\mathrm{i}} = \frac{[ES][I]}{[ESI]} \;\;\;\mbox{・・・式4}$$

阻害剤が存在しない場合

$$ V_0 = \frac{V_{\mathrm{max}} [S]}{K_{\mathrm{m}} + [S]}$$

阻害剤が存在する場合

酵素濃度の保存則は

$$ [E]_0 = [E] + [ES] + [EI] + [ESI] \;\;\;\mbox{・・・式5}$$

式5に式3および式4を代入すると

$$[E]_0 = [E] + [ES] + \frac{[E] [I]}{K_{\mathrm{i}}} + \frac{[ES][I]}{\alpha K_{\mathrm{i}}} \;\;\;\mbox{・・・式6}$$

となります。これを変形すると

$$ [E] = \frac{[E]_0 – \left( 1 + \frac{[I]}{\alpha K_{\mathrm{i}}}\right) [ES] }{ 1 + \frac{[I]}{K_{\mathrm{i}}}} \;\;\;\mbox{・・・式7}$$

となります。

式2と式7を連立して [ES] について解くと

$$ [ES] = \frac{[E]_0 [S]}{K_{\mathrm{m}}\left(1+ \frac{[I]}{K_{\mathrm{i}} }\right) + [S] \left( 1 + \frac{[I]}{\alpha K_{\mathrm{i}} }\right)} $$

となります。

したがって阻害剤が存在する時の反応速度 \(V_I \)（\(V_I = k_{cat} [ES]\)、\(k_{cat} [E]_0 = V_{\mathrm{max}}\)）は

$$ V_I = \frac{V_{\mathrm{max}} [S]}{K_{\mathrm{m}}\left(1+ \frac{[I]}{K_{\mathrm{i}} }\right) + [S] \left( 1 + \frac{[I]}{\alpha K_{\mathrm{i}} }\right)} $$

と表わされます。

\( [I] = [I]_{50}\) の時、\( V_0 = 2 V_I \) であるため、

$$ \frac{V_{\mathrm{max}} [S]}{K_{\mathrm{m}} + [S]} = \frac{2 V_{\mathrm{max}} [S]_{50}}{K_{\mathrm{m}}\left(1+ \frac{[I]_{50}}{K_{\mathrm{i}} }\right) + [S]_{50} \left( 1 + \frac{[I]_{50}}{\alpha K_{\mathrm{i}} }\right)} $$

という関係式が得られます。この式を変形すると

$$[I]_{50} = \frac{[S]_{50} + 2\frac{[S]_{50}}{[S]}K_{\mathrm m} – K_{\mathrm m}}{ \frac{K_{\mathrm m}}{K_{\mathrm i}} + \frac{[S]_{50}}{\alpha K_{\mathrm i}}}$$

となります。

基質が酵素に対して十分過剰で、酵素に結合している基質の割合が小さく、さらに生成物への変換が無視できる初速度測定条件では、\[[ES]+[ESI]\ll[S]_0,\qquad[P]\ll[S]_0\]が成り立ちます。この場合、阻害剤が存在しない時と50%阻害時の遊離基質濃度を、いずれも初期基質濃度で近似できます。

\[ [S]\simeq[S]_{50}\simeq[S]_0\]

これを上式に代入すると、\[[I]_{50}\simeq\frac{[S]_0+K_{\mathrm m}}{\dfrac{K_{\mathrm m}}{K_{\mathrm i}}+\dfrac{[S]_0}{\alpha K_{\mathrm i}}} \]となります。

さらに、阻害剤濃度が酵素濃度に対して十分に過剰（\([I] \gg [EI] + [ESI]\)）であれば、遊離型阻害剤濃度 \( [I]_{50}\) を全阻害剤濃度 \(\mathrm{IC}_{50} \) で近似でき、$$ \mathrm{IC}_{50} = \frac{[S]_0 + K_{\mathrm{m}} }{\frac{K_{\mathrm{m}}}{K_{\mathrm{i}}} + \frac{[S]_0}{\alpha K_{\mathrm{i}} } } \;\;\;\mbox{・・・式1}$$式1が導かれます。

参考文献

• 安達弥永, 安保智子, 藤島美紀, 渡邊治夫、ヒト肝ミクロソームのチトクロームP-450活性へのスギナエキスの影響と血中薬剤との相互作用予測. 生活衛生 2010, 54, 137–145. DOI: 10.11468/seikatsueisei.54.137
• Buker, S. M.; Boriack–Sjodin, P. A.; Copeland, R. A. Enzyme–Inhibitor Interactions and a Simple, Rapid Method for Determining Inhibition Modality. SLAS Discovery 2019, 24, 515–522. DOI: 10.1177/2472555219829898
• Cheng, Y.- C.; Prusoff, W. H. Relationship between the inhibition constant (K_I) and the concentration of inhibitor which causes 50 per cent inhibition (I₅₀) of an enzymatic reaction. Biochem. Pharmacol. 1973, 22, 3099–3108. DOI: 10.1016/0006-2952(73)90196-2
• プロメガ株式会社「テックの一言コラム_2015年9月号 これから創薬を始める方へ ～ 酵素阻害剤編 ～」(2025年12月16日閲覧).

Kiが非常に小さい阻害剤（Tight-binding inhibitor）の場合

まとめ（引用）

強い阻害剤（\([I] \approx [E]\)）のK_iの具体的な算出には，線形型のHendersonプロット，あるいはMorrisonの式を用いた非線形回帰分析を行う．ただし，HendersonプロットやMorrisonの式から求まるものは見かけの \(K_{\mathrm{i}}\)（\(K^{\mathrm{app}}_{\mathrm{i}}\)）であり, … \(K_{\mathrm{i}}\)への変換を要する．

— 知名秀泰・岡田豊、2014

Morrisonの式

遊離阻害剤濃度 \([I]\) を総阻害剤濃度 \([I]_{\mathrm T}\) で近似できない場合には、阻害剤の物質収支を考慮する必要があります。遊離基質濃度が阻害剤の添加によって実質的に変化せず、阻害剤が結合した酵素は活性を持たないモデルでは、Morrison式を用いて見かけの阻害定数 \(K_{\mathrm i}^{\mathrm{app}}\) を求められます。

\[\frac{V_I}{V_0} = 1 – \frac{[E]_0 + [I]_\mathrm{T} + K_\mathrm{i}^\mathrm{app} – \sqrt{([E]_0 + [I]_\mathrm{T} + K_\mathrm{i}^\mathrm{app})^2 – 4[E]_0[I]_\mathrm{T}}}{2[E]_0}\]

各阻害様式における \(K_{\mathrm i}^{\mathrm{app}}\) と阻害定数の関係は、次のとおりです。

拮抗阻害：\(K_{\mathrm i}\left(1+\frac{[S]}{K_{\mathrm m}}\right)\)

混合型阻害：\(\frac{\alpha K_{\mathrm i}(K_{\mathrm m}+[S])}{\alpha K_{\mathrm m}+[S]}\)

純粋な非拮抗阻害では \(\alpha=1\) なので、\[K_{\mathrm i}^{\mathrm{app}}=K_{\mathrm i}\]となります。

不拮抗阻害： \(\alpha K_{\mathrm i}\left(1+\frac{K_{\mathrm m}}{[S]}\right)\)

ここで、不拮抗阻害における \(\alpha K_{\mathrm i}\) は、ESに対する阻害剤の有限の解離定数を表します。

Morrison式で \(V_I/V_0=1/2\) とすると、50%阻害時には総酵素の半分に阻害剤が結合しています。また、この時の遊離阻害剤濃度は \(K_{\mathrm i}^{\mathrm{app}}\) に等しいため、総阻害剤濃度としての \(\mathrm{IC}_{50}\) は、\[K_{\mathrm i}^{\mathrm{app}}+\frac{[E]_0}{2}\]となります。

したがって、純粋な非拮抗阻害でも、tight-binding条件では、\[K_{\mathrm i}+\frac{[E]_0}{2}
\]です。\([E]_0/2\) が \(K_{\mathrm i}\) に比べて十分小さい場合に、\(\mathrm{IC}_{50}\simeq K_{\mathrm i}\) と近似できます。

参考文献

• 知名秀泰, 岡田豊、続・生物工学基礎講座 バイオよもやま話 原典からの酵素反応速度論. 生物工学会誌 2014, 92, 20–25. https://www.sbj.or.jp/sbj/sbj_vol92_no01.html
• Morrison , J. F. Kinetics of the reversible inhibition of enzyme-catalysed reactions by tight-binding inhibitors. Biochim. Biophys. Acta, Enzymol. 1969, 185, 269–286. DOI: 10.1016/0005-2744(69)90420-3
• Copeland, R. A. Tight-binding inhibitor. Enzymes: A Practical Introduction to Structure, Mechanism, and Data Analysis, 2nd ed.; Wiley, 2000, 205–317. DOI: 10.1002/0471220639.ch9

基質と阻害剤の両方の枯渇を無視できない場合：拮抗阻害

基質と阻害剤が酵素に対して互いに排他的に結合する拮抗阻害を考えます。ここではESIは形成されず、迅速平衡近似が成立し、生成物の蓄積は無視できるものとします。

基質と阻害剤の両方について、酵素への結合による遊離濃度の低下を考慮する場合、酵素–阻害剤複合体の濃度 \([EI]\) は、Wang（1995）の競合結合式によって次のように表されます。

$$ [EI] = \frac{ [I]_{\mathrm{T}} \{2\sqrt{(a^2 – 3b)} \cos (\Theta/3) – a \} }{ 3K_{\mathrm{i}} + \{2\sqrt{(a^2 – 3b)} \cos (\Theta/3) – a \} } $$

上式において、

$$ a = K_{\mathrm{s}} + K_{\mathrm{i}} + [S]_{\mathrm{T}} + [I]_{\mathrm{T}} – [E]_{\mathrm{T}} $$

$$ b = K_{\mathrm{i}} ([S]_{\mathrm{T}} – [E]_{\mathrm{T}}) + K_{\mathrm{s}} ([I]_{\mathrm{T}} – [E]_{\mathrm{T}}) + K_{\mathrm{s}} K_{\mathrm{i}} $$

$$ c = -K_{\mathrm{s}} K_{\mathrm{i}} [E]_{\mathrm{T}} $$

$$ \Theta = \arccos \frac{-2a^3 + 9ab – 27c}{2\sqrt{(a^2-3b)^3}} $$

この式は競合結合系に対する式であり、ESIを形成する非拮抗阻害や不拮抗阻害には、そのまま適用できません。

また、基質の枯渇が無視できない場合、阻害剤の添加によって遊離基質濃度も変化します。このため、反応速度比は一般に \(1-[EI]/[E]_{\mathrm T}\) では表せず、\[\frac{[ES]_I}{[ES]_{\text{阻害剤なし}}}\]から計算します。ここで、\([ES]_I\) と \([ES]_{\text{阻害剤なし}}\) は、同じ総酵素濃度および総基質濃度について、それぞれ阻害剤存在下と非存在下で求めたES濃度です。

参考文献

• Wang, Z.-X. An exact mathematical expression for describing competitive binding of two different ligands to a protein molecule. FEBS Lett. 1995, 360, 111–114. DOI: 10.1016/0014-5793(95)00062-E