非拮抗阻害ではIC50 = Ki

先日の文献セミナーで酵素阻害剤の阻害様式とIC₅₀とK_iの関係についてよく分かっていなくて、頓珍漢な質問をしてしまったのでメモ。

まとめ（引用）

まず結論を引用します。

IC₅₀とK_i値の関係は、in vitroの試験では [S] >> K_mが成立するので、非拮抗阻害や不拮抗阻害ではIC₅₀ = K_iであり、拮抗阻害ではK_i = IC₅₀/(1 + [S]/K_m) からK_i値が換算される（K_m: ミカエリス定数、K_i: 阻害定数）
— 安達ら、2010

解説

解説と画像はBuker, S. M., et al., Enzyme–Inhibitor Interactions and a Simple, Rapid Method for Determining Inhibition Modality. SLAS Discovery 2019, 24, 515–522からの引用です。

各阻害様式の定義（純粋型）

• （純粋な）拮抗阻害（competitive inhibition; 競合阻害/競争阻害）では、阻害剤 I は E にのみ結合する。
• 非拮抗阻害（non-competitive inhibition; 非競合阻害/非競争阻害）では、阻害剤 I は E にも ES にも同じ親和性で結合する。
• （純粋な）不拮抗阻害（uncompetitive inhibition; 不競合阻害/不競争阻害）では、阻害剤 I は ES にのみ結合する。

IC₅₀とK_iの一般式

50%阻害濃度IC₅₀と阻害定数K_iの関係は以下の近似式（式1）で表わされます。

\[ {\mathrm{IC}}_{50} = \frac{[S]_0 + K_{\mathrm m}}{\frac{K_{\mathrm m}}{K_{\mathrm i}} + \frac{[S]_0}{\alpha K_{\mathrm i}}} \;\;\;\mbox{・・・式1}\]

式1において、\([S]_0\) は基質の初期濃度を表わします: \([S]_0 = [S] + [ES] + [ESI] + [P] \)。

この式は混合型阻害（mixed-type inhibition; K_i ≠ αK_i）に対するCheng–Prusoff式（Cheng and Prusoff, 1973のCase II）と同一です。阻害様式を解析する目的で、IC₅₀を [S]₀/K_mに対してプロットしたいので、式1を変形すると次のようになります。 $$ {\mathrm{IC}}_{50} = \frac{1 + \frac{[S]_0}{K_{\mathrm m}}}{\frac{1}{K_{\mathrm i}} + \left(\frac{1}{\alpha K_{\mathrm i}} \times \frac{[S]_0}{K_{\mathrm m}}\right)} $$

各阻害様式での極限

拮抗阻害（\(\alpha\to \infty\)）

$$ {\mathrm{IC}}_{50} = \frac{1 + \frac{[S]}{K_{\mathrm m}}}{\frac{1}{K_{\mathrm i}}} = K_{\mathrm i} \left(1 + \frac{[S]}{K_{\mathrm m}}\right)$$

非拮抗阻害（\(\alpha = 1\)）

$$ {\mathrm{IC}}_{50} = K_{\mathrm i}$$

不拮抗阻害（\(K_{\mathrm i}\to \infty\)、ただし\( \alpha K_{\mathrm i}\) が有限の場合）

$$ {\mathrm{IC}}_{50} = \alpha K_{\mathrm i} \left(1 + \frac{K_{\mathrm m}}{[S]}\right)$$

特に\([S] \gg K_{\mathrm m}\)の条件下では、

$$ \mathrm{IC}_{50} \sim \alpha K_{\mathrm i} $$

まとめの表:

阻害機構	パラメータ	IC50
拮抗（competitive）	\(\alpha\to \infty \)	\( K_{\mathrm i} \left(1 + \frac{[S]}{K_{\mathrm m}}\right)\)
非拮抗（non-competitive）	\( \alpha = 1 \)	\( K_{\mathrm i}\)
不拮抗（uncompetitive）	\(K_{\mathrm i}\to \infty\)、\( \alpha K_{\mathrm i} \ll K_{\mathrm i}\)	\( \alpha K_{\mathrm i} \left(1 + \frac{K_{\mathrm m}}{[S]}\right)\)
混合（mixed）	–	\( \frac{[S] + K_{\mathrm m}}{\frac{K_{\mathrm m}}{K_{\mathrm i}} + \frac{[S]}{\alpha K_{\mathrm i}}} \)

それぞれの阻害様式について、 [S]/K_mに対してIC₅₀をプロットしたものが以下の図です。

セミナーで紹介された論文ではこのプロットが “Cheng–Prusoff plot” と呼ばれていました。

式1の導出

導出はCheng and Prusoff, 1973のCase IIから。

反応系は迅速に平衡に達すると仮定します。したがって、\(k_{-1} \gg k_{cat} \) なので、\(K_{\mathrm{s}} = K_{\mathrm{m}} + \frac{k_{cat}}{k_{-1}} \sim K_{\mathrm{m}} \) が成り立ちます。

定義式

$$ K_{\mathrm{m}} \sim K_{\mathrm{s}} = \frac{[E][S]}{[ES]} \;\;\;\mbox{・・・式2}$$

$$ K_{\mathrm{i}} = \frac{[E][I]}{[EI]} \;\;\;\mbox{・・・式3}$$

$$ \alpha K_{\mathrm{i}} = \frac{[ES][I]}{[ESI]} \;\;\;\mbox{・・・式4}$$

阻害剤が存在しない場合

$$ V_0 = \frac{V_{\mathrm{max}} [S]}{K_{\mathrm{m}} + [S]}$$

阻害剤が存在する場合

酵素濃度の保存則は

$$ [E]_0 = [E] + [ES] + [EI] + [ESI] \;\;\;\mbox{・・・式5}$$

式5に式3および式4を代入すると

$$[E]_0 = [E] + [ES] + \frac{[E] [I]}{K_{\mathrm{i}}} + \frac{[ES][I]}{\alpha K_{\mathrm{i}}} \;\;\;\mbox{・・・式6}$$

となります。これを変形すると

$$ [E] = \frac{[E]_0 – \left( 1 + \frac{[I]}{\alpha K_{\mathrm{i}}}\right) [ES] }{ 1 + \frac{[I]}{K_{\mathrm{i}}}} \;\;\;\mbox{・・・式7}$$

となります。

式2と式7を連立して [ES] について解くと

$$ [ES] = \frac{[E]_0 [S]}{K_{\mathrm{m}}\left(1+ \frac{[I]}{K_{\mathrm{i}} }\right) + [S] \left( 1 + \frac{[I]}{\alpha K_{\mathrm{i}} }\right)} $$

となります。

したがって阻害剤が存在する時の反応速度 \(V_I \)（\(V_I = k_{cat} [ES]\)、\(k_{cat} [E]_0 = V_{\mathrm{max}}\)）は

$$ V_I = \frac{V_{\mathrm{max}} [S]}{K_{\mathrm{m}}\left(1+ \frac{[I]}{K_{\mathrm{i}} }\right) + [S] \left( 1 + \frac{[I]}{\alpha K_{\mathrm{i}} }\right)} $$

と表わされます。

\( [I] = [I]_{50}\) の時、\( V_0 = 2 V_I \) であるため、

$$ \frac{V_{\mathrm{max}} [S]}{K_{\mathrm{m}} + [S]} = \frac{2 V_{\mathrm{max}} [S]_{50}}{K_{\mathrm{m}}\left(1+ \frac{[I]_{50}}{K_{\mathrm{i}} }\right) + [S]_{50} \left( 1 + \frac{[I]_{50}}{\alpha K_{\mathrm{i}} }\right)} $$

という関係式が得られます。この式を変形すると

$$[I]_{50} = \frac{[S]_{50} + 2\frac{[S]_{50}}{[S]}K_{\mathrm m} – K_{\mathrm m}}{ \frac{K_{\mathrm m}}{K_{\mathrm i}} + \frac{[S]_{50}}{\alpha K_{\mathrm i}}}$$

となります。

基質濃度が酵素濃度に対して十分大きければ、遊離型基質濃度\([S]\)および\([S]_{50}\)を初期濃度\([S]_0\)で近似できるので、上式の\([S]\)および\([S]_{50}\)を\([S]_0\)に置換してから上式を変形すると

$$ [I]_{50} = \frac{[S]_0 + K_{\mathrm{m}} }{\frac{K_{\mathrm{m}}}{K_{\mathrm{i}}} + \frac{[S]_0}{\alpha K_{\mathrm{i}} } } $$

となります。

さらに、阻害剤濃度が酵素濃度に対して十分に過剰（\([I] \gg [EI] + [ESI]\)）であれば、遊離型阻害剤濃度 \( [I]_{50}\) を全阻害剤濃度 \(\mathrm{IC}_{50} \) で近似でき、

$$ \mathrm{IC}_{50} = \frac{[S]_0 + K_{\mathrm{m}} }{\frac{K_{\mathrm{m}}}{K_{\mathrm{i}}} + \frac{[S]_0}{\alpha K_{\mathrm{i}} } } \;\;\;\mbox{・・・式1}$$

式1が導かれます。

参考文献

• 安達弥永, 安保智子, 藤島美紀, 渡邊治夫、ヒト肝ミクロソームのチトクロームP-450活性へのスギナエキスの影響と血中薬剤との相互作用予測. 生活衛生 2010, 54, 137–145. DOI: 10.11468/seikatsueisei.54.137
• Buker, S. M.; Boriack–Sjodin, P. A.; Copeland, R. A. Enzyme–Inhibitor Interactions and a Simple, Rapid Method for Determining Inhibition Modality. SLAS Discovery 2019, 24, 515–522. DOI: 10.1177/2472555219829898
• Cheng, Y.- C.; Prusoff, W. H. Relationship between the inhibition constant (K_I) and the concentration of inhibitor which causes 50 per cent inhibition (I₅₀) of an enzymatic reaction. Biochem. Pharmacol. 1973, 22, 3099–3108. DOI: 10.1016/0006-2952(73)90196-2
• プロメガ株式会社「テックの一言コラム_2015年9月号 これから創薬を始める方へ ～ 酵素阻害剤編 ～」(2025年12月16日閲覧).

Kiが非常に小さい阻害剤（Tight-binding inhibitor）の場合

まとめ（引用）

強い阻害剤（\([I] \approx [E]\)）のK_iの具体的な算出には，線形型のHendersonプロット，あるいはMorrisonの式を用いた非線形回帰分析を行う．ただし，HendersonプロットやMorrisonの式から求まるものは見かけの \(K_{\mathrm{i}}\)（\(K^{\mathrm{app}}_{\mathrm{i}}\)）であり, … \(K_{\mathrm{i}}\)への変換を要する．

— 知名秀泰・岡田豊、2014

Morrisonの式

遊離型阻害剤濃度 \( [I]\) を全阻害剤濃度 \([I]_{\mathrm{T}} \) で近似できない場合、Morrisonの式（Morrison equation）を使って、非線形回帰分析により見かけの \(K_{\mathrm{i}}\)値（ \(K^{\mathrm{app}}_{\mathrm{i}}\)）を求める（Morrison, 1969; Copeland, 2000）。

$$ \frac{V_I}{V_0} = 1 – \frac{ ([E]_0 + [I]_{\mathrm{T}}) + K^{\mathrm{app}}_{\mathrm{i}} ) – \sqrt{ ([E]_0 + [I]_{\mathrm{T}}) + K^{\mathrm{app}}_{\mathrm{i}} )^2 – 4 [E]_0 [I]_{\mathrm{T}} } }{ 2 [E]_0 } $$

拮抗阻害: $$ K^{\mathrm{app}}_{\mathrm{i}} = K_{\mathrm{i}} \left( 1 + \frac{[S]}{K_{\mathrm{m}}} \right)$$

非拮抗阻害: $$ K^{\mathrm{app}}_{\mathrm{i}} = \frac{\alpha K_{\mathrm{i}} (K_{\mathrm{m}} + [S] )}{\alpha K_{\mathrm{m}} + [S]} $$ \(\alpha = 1\) の時: $$K^{\mathrm{app}}_{\mathrm{i}} = K_{\mathrm{i}} $$

不拮抗阻害: $$ K^{\mathrm{app}}_{\mathrm{i}} = K_{\mathrm{i}} \left( 1 + \frac{K_{\mathrm{m}}} {[S]}\right)$$

参考文献

• 知名秀泰, 岡田豊、続・生物工学基礎講座 バイオよもやま話 原典からの酵素反応速度論. 生物工学会誌 2014, 92, 20–25. https://www.sbj.or.jp/sbj/sbj_vol92_no01.html
• Morrison , J. F. Kinetics of the reversible inhibition of enzyme-catalysed reactions by tight-binding inhibitors. Biochim. Biophys. Acta, Enzymol. 1969, 185, 269–286. DOI: 10.1016/0005-2744(69)90420-3
• Copeland, R. A. Tight-binding inhibitor. Enzymes: A Practical Introduction to Structure, Mechanism, and Data Analysis, 2nd ed.; Wiley, 2000, 205–317. DOI: 10.1002/0471220639.ch9

基質と阻害剤の両方がTight-bindingの場合

酵素阻害剤複合体の濃度 [EI] は以下の式で表わされる（Wang, 1995）。

$$ [EI] = \frac{ [I]_{\mathrm{T}} \{2\sqrt{(a^2 – 3b)} \cos (\Theta/3) – a \} }{ 3K_{\mathrm{i}} + \{2\sqrt{(a^2 – 3b)} \cos (\Theta/3) – a \} } $$

上式において、

$$ a = K_{\mathrm{s}} + K_{\mathrm{i}} + [S]_{\mathrm{T}} + [I]_{\mathrm{T}} – [E]_{\mathrm{T}} $$

$$ b = K_{\mathrm{i}} ([S]_{\mathrm{T}} – [E]_{\mathrm{T}}) + K_{\mathrm{s}} ([I]_{\mathrm{T}} – [E]_{\mathrm{T}}) + K_{\mathrm{s}} K_{\mathrm{i}} $$

$$ c = -K_{\mathrm{s}} K_{\mathrm{i}} [E]_{\mathrm{T}} $$

$$ \Theta = \arccos \frac{-2a^3 + 9ab – 27c}{2\sqrt{(a^2-3b)^3}} $$

参考文献

• Wang, Z.-X. An exact mathematical expression for describing competitive binding of two different ligands to a protein molecule. FEBS Lett. 1995, 360, 111–114. DOI: 10.1016/0014-5793(95)00062-E