結合阻害定数Kiの計算式について

研究室内向けメモ.Sepetember 28, 2021改訂.

“Munson–Rodbard equation is all you need…?”

結合阻害定数\(K_{\rm i}\)を計算する方法としては、よく知られているCheng–Prusoff式の他に、より近似の少ないGoldstein–Barrett式、非標識リガンドの総濃度(50%結合阻害総濃度\({\rm IC}_{50}\))を近似なしに計算に使用できるMunson–Rodbard式があります。また、50%阻害結合(遊離)濃度 \([\rm{I}]_{50}\) を求める方法には非線形回帰と線形回帰があります。これらの方法で結合阻害定数\(K_{\rm i}\)を計算した時に、シミュレーションの真の\(K_{\rm i}\)値とのずれがどの程度なのかを調べました。

計算のパラメータには受容体としてプロテインキナーゼC δ-C1Bドメイン、放射性標識リガンドとして [3H]phorbol 12,13-dibutyrate([3H]PDBu)を使用した時の典型的な値を使いました: 受容体総濃度\([R_{\textrm T}] = 3.45\; \textrm{nM}\), 放射性標識リガンド総濃度\([L_{\textrm T}] = 17\; \textrm{nM}\), 放射性標識リガンドの受容体に対する解離定数\(K_{\textrm d} = 0.53\; \textrm{nM}\)。非標識リガンドの濃度範囲は、\(K_{\rm i}\) = 0.1 nMの時log[IT] が−9.172から−7.459; 1 nMの時−8.454から−6.496; 10 nMの時−7.495から−5.500; 100 nMの時−6.500から−4.500です(50%を挟むおおよそ−0.5刻みの5点)。

得られるIC50の値は、非線形回帰(標準シグモイド関数でフィッティング)と線形回帰(ロジット変換)とでほとんど差はありませんでした。

真のKi[I50] (nM)真のIC50 (nM)IC50 (非線形回帰、標準シグモイド)IC50 (線形回帰、ロジット変換)
0.1 nM3.024.754.714.68
1 nM30.231.931.931.9
10 nM302304303303
100 nM3019302030153014
  見掛けのKi値 (nM)
真のKi f([IT])a Cheng–Prusoff Cheng–Prusoffb Goldstein–Barrettc Munson–Rodbard
0.1 nM 0.155 0.142 0.157 0.156 0.0987
1 nM 1.05 0.964 1.07 1.06 1.00
10 nM 10.02 9.16 10.12 10.04 9.98
100 nM 99.6 91.1 101 99.8 99.8
a \(\theta = f([I_\mathrm{T}]) = \frac{K_{\rm d} + [L_0]}{\frac{K_{\rm d}}{K_{\rm i}}[I_\mathrm{T}] + K_{\rm d} + [L_{50}]} \times \frac{[L_{50}]}{[L_0]}\) に対して非線形回帰。
b [LT] の代わりに [L50] を使用して計算した。 c 式内の\([{\rm I}_{50}]\)を\({\rm IC}_{50}\)で近似した。

分かったこと:

  • 真の値とのずれが大きいので(オリジナルの)Cheng–Prusoff式を使う理由はない。
  • 非線形回帰で直接パラメータKiを求める方法、[L50] を使ったCheng–Prusoff式、Goldstein–Barrett式は、Ki ≧ 10 nMの場合に真のKi値と有効数字2桁で一致する。これらの3つの方法の精度はほぼ同じ。
  • Munson–Rodbard式は全ての条件でかなり正確。特に [I50] とIC50の差が開いてくるKi < 1 nMの場合は、Munson–Rodbard式を使う必要がある。

 

Contents

計算に使用する数値のBinding assayからの算出方法

Binding assayの方法はSharkey & Blumberg (1985) に多少の変更点を加えています.

平衡状態での非特異的結合は無視します.

[RL0] = [pellet(total)] − k × [supernatant(total)] × 437/50

Pelletに対する非特異的吸着 (主にγグロブリン) と上清との間の放射標識リガンドの分配係数 k = [pellet(nonspecific)] / ([supernatant(nonspecific)] × 437/50)

[LT] = [pellet(total)] + [supernatant(total)] × 437/50

[L0] = [supernatant(total)] = ([LT] − [RL0])/(1 + k)

[L50] = ([LT] − [RL0]/2)/(1 + k)

[RT] = Kd [RL0] / [L0] + [RL0]

放射活性DPM(壊変毎分)をモル濃度 (nM) に換算する係数N:
\[
N = \frac{1}{60} \times \frac{1}{3.7 \times 10^{10}} \times \frac{1}{\mbox{比活性 (Ci/mmol)}} \times \frac{1}{10^3} \times \frac{1}{250 \times 10^{-6}} \times 10^9
\]

非特異的結合について

細胞の膜画分をbinding assayに用いる場合、膜タンパク質への低親和性結合やリン脂質への分配、分離フィルターへの吸着などの非特異的結合が起こる。通常これらの低親和性過程は不飽和であり、非特異的結合係数 (\(k\)) とfree放射リガンド濃度 \([L]\) の積としてモデル化できる (Hulme and Trevethick, 2010)。

[3H]PDBu結合試験では、ポリエチレングリコール (PEG) を添加してタンパク質を凝集させますが(PEG沈)、共沈剤としてγ-グロブリンを系に加えているため、γ-グロブリンに対する非特異的吸着が起きます(通常分配係数 k = 3–5%程度)。この非特異的吸着が [RL0] と [L0] にどの程度影響を与えるか計算してみたところ、k = 0の時 [RL0] = 3.321 nM、[L0] = 13.7 nM、k = 0.04の時 [RL0] = 3.316 nM、[L0] = 13.2 nMでした。リガンド濃度が十分高ければ、bound [RL] にはほとんど影響がないため、free [L] の値だけ k で補正すればよいでしょう。

非標識リガンドのγ-グロブリンに対する非特異的結合については、分配係数が測れないため、考慮することができません。仮に非標識リガンドのγ-グロブリンに対する分配係数が [3H]PDBuの分配係数と等しいとすると、加えた非標識リガンドの濃度を (1 + k) で割って補正することで、[IT]のよい推定値が得られます。例えば、真のKiが10 nMのリガンドの分配係数 k = 0.04と仮定した場合、Munson–Rodbard式で計算した見掛けのKi値は、補正なしで10.47 nM、補正ありで10.06 nMでした。

Goldstein–Barrett式とCheng–Prusoff式

使用するパラメータ

Total binding群

\begin{equation}
[R_0] + [L_0] \rightleftharpoons [RL_0]
\end{equation}
\begin{equation}
K_{\rm d} = \frac{[R_0][L_0]}{[RL_0]}
\end{equation}
\begin{equation}
[R_{\rm T}] = [R_0] + [RL_0]
\end{equation}
\begin{equation}
K_{\rm d} = \frac{([R_{\rm T}] – [RL_0])[L_0]}{[RL_0]}
\end{equation}
\begin{equation}
[RL_0] = \frac{[R_{\rm T}][L_0]}{K_{\rm d} + [L_0]}
\end{equation}

Competitive inhibition群

\([I]\): 遊離の非標識リガンド濃度

\begin{equation}
[RI] \rightleftharpoons [I] + [R] + [L] \rightleftharpoons [RL]
\end{equation}
\begin{equation}
K_{\rm i} = \frac{[R][I]}{[RI]}
\end{equation}
\begin{equation}
[R_{\rm T}] = [RI] + [R] + [RL]
\end{equation}
\begin{equation}
[R_{\rm T}] = \frac{[R][I]}{K_{\rm i}} + [R] + [RL]
\end{equation}
\begin{equation}
[R_{\rm T}] = \left(1+\frac{[I]}{K_{\rm i}}\right)[R] + [RL]
\end{equation}
\begin{equation}
[R_{\rm T}] = \left(1+\frac{[I]}{K_{\rm i}}\right)\frac{K_{\rm d}[RL]}{[L]}+ [RL]
\end{equation}
\begin{equation}
[RL] = \frac{[R_{\rm T}][L]}{\left(1+\frac{[I]}{K_{\rm i}}\right)K_{\rm d} + [L]}
\end{equation}

Goldstein–Barett式の導出

50%結合阻害時

50%結合阻害時を考える.

\begin{equation}
\frac{1}{2}[RL_0] = [RL_{50}]
\end{equation}
\begin{equation}
\frac{1}{2}\frac{[R_{\rm T}][L_0]}{K_{\rm d} + [L_0]} = \frac{[R_{\rm T}][L_{50}]}{\left(1+\frac{[I_{50}]}{K_{\rm i}}\right)K_{\rm d} + [L_{50}]}
\end{equation}

\begin{equation}
2\frac{K_{\rm d} }{[L_0]} + 2 = \left(1+\frac{[I_{50}]}{K_{\rm i}}\right)\frac{K_{\rm d} }{[L_{50}]}
+ 1
\end{equation}


\begin{equation}
2\frac{[L_{50}]}{[L_0]} + \frac{[L_{50}]}{K_{\rm d}} = 1+\frac{[I_{50}]}{K_{\rm i}}
\end{equation}


\begin{equation}
K_{\rm i} = \frac{[I_{50}]}{2\frac{[L_{50}]}{[L_0]} – 1 + \frac{[L_{50}]}{K_{\rm d}}} \;\;\;\;\mbox{(Goldstein and Barrett, 1987)}
= \frac{[I_{50}]}{1 + \frac{[L_{50}]}{K_{\rm d}} + 2\frac{[L_{50}]-[L_0]}{[L_0]}}
\end{equation}

Cheng–Prusoff式への変換

レセプター濃度 \([R]\) に対して \([L]\) が十分大きければ、\([L_0] \simeq [L_{50}]\) かつ\([L_{50}] \simeq [L_{\rm T}]\)なので

\begin{equation}
K_{\rm i} = \frac{[I_{50}]}{1 + \frac{[L_{\rm T}]}{K_{\rm d}}}
\end{equation}

レセプター濃度 \([R]\) に対して \([I]\) が十分大きければ、\([I_{50}]\) は50%阻害時のリガンド総濃度\(\textrm{IC}_{50}\)に近似できるので
\begin{equation}
K_{\rm i} = \frac{\textrm{IC}_{50}}{1+\frac{[L_{\rm T}]}{K_{\rm d}}} \;\;\;\mbox{(Cheng–Prusoff equation)}
\end{equation}

非線形回帰によるKiの推定

上記の理想的式はリガンドの結合に協同性がない場合 (\(n = 1\)) のHillの式に相当する.

\(\theta = [RL]/[RL_0]\)とすると,
\begin{equation}
\theta = \frac{[R_{\rm T}][L]}{\left(1+\frac{[I]}{K_{\rm i}}\right)K_{\rm d} + [L]} \times \frac{K_{\rm d} + [L_0]}{[R_{\rm T}][L_0]}
\end{equation}

\begin{equation}
\theta = \frac{K_{\rm d} + [L_0]}{\frac{K_{\rm d}}{K_{\rm i}}[I] + K_{\rm d} + [L]} \times \frac{[L]}{[L_0]}
\end{equation}

図1. Inhibition curve の simulation. \([R_{\textrm T}] = 3.45\; \textrm{nM}\), \([L_{\textrm T}] = 17\; \textrm{nM}\), \(K_{\textrm d} = 0.53\; \textrm{nM}\), \(K_{\textrm i} = 11\; \textrm{nM}\).縦軸は\(\theta = [RL]/[RL_0]\),横軸はfreeのunlabelled ligandの対数濃度 \(\log [I]\).

上の図1の横軸をunlabelled ligandの対数濃度 \(\log [I]_{\textrm T}\) に変更した。

図2. Inhibition curve の simulation. 横軸が \(\log [I]_{\textrm T}\).

data.csv

logIT,theta
-9.495,0.999
-8.995,0.997
-8.495,0.990
-7.995,0.968
-7.496,0.906
-6.996,0.759
-6.498,0.512
-5.999,0.259
-5.500,0.102
-5.000,0.035
-4.500,0.011
-4.000,0.004

Rを使って非線形回帰を試してみる。

1) θ = f([I])

\(\theta = f([I]) = \frac{K_{\rm d} + [L_0]}{\frac{K_{\rm d}}{K_{\rm i}}[I] + K_{\rm d} + [L]} \times \frac{[L]}{[L_0]}\)中の \([L]\) の値は \([I]\) が変化すると変化してしまう。 この点については、変数\([L]\) に定数 \([L_{50}]\) を代入してみる。また、本来は遊離非標識リガンド濃度 \([I]\) の関数だが、 \([I]\) は分からないので、加えた総濃度 \([I_\rm{T}]\) で近似する。

> simulation <- read.csv("data.csv")
> simulation$IT <- 10^(simulation$logIT + 9)
> result1 = nls(theta~(0.53 + 13.679)/(0.53/Ki * IT + 0.53 + 15.339) * 15.339/13.679,data=simulation,start = c(Ki = 10))
> summary(result1)

Formula: theta ~ (0.53 + 13.679)/(0.53/Ki * IT + 0.53 + 15.339) * 15.339/13.679

Parameters:
   Estimate Std. Error t value Pr(>|t|)    
Ki  11.0184     0.1833   60.12 3.34e-15 ***
---
Signif. codes:  0 ‘***’ 0.001 ‘**’ 0.01 ‘*’ 0.05 ‘.’ 0.1 ‘ ’ 1

Residual standard error: 0.006362 on 11 degrees of freedom

Number of iterations to convergence: 4 
Achieved convergence tolerance: 1.598e-06

フィッティング度合いの可視化

> plot(theta~IT, data=simulation, log="x")
> concpre = seq(-10, -3.5, length=100)
> concpre <- 10^(concpre + 9)
> lines(concpre, predict(result1, newdata=list(IT=concpre)))

\([L]\) を固定値にしているせいで、曲線の当て嵌まりがあまり良くない。Ki = 11.0184 nMと理論値 (11 nM) とほぼ等しい値を求めることはできている。


回帰によるIC50の推定

非線形回帰

1) 相補誤差関数(erfc)にフィッティング(※範囲を0から1にするため1/2を掛けている)

> simulation <- read.csv("data.csv")
> erfc <- function(x) 2 * pnorm(x * sqrt(2), lower=FALSE) 
> result2 = nls(theta~1/2*erfc((logIT - logIC50)/a), data = simulation, start = c(logIC50=-6.5, a=1))
> summary(result2)

Formula: theta ~ 1/2 * erfc((logIT - logIC50)/a)

Parameters:
         Estimate Std. Error t value Pr(>|t|)    
logIC50 -6.476263   0.006851 -945.27  < 2e-16 ***
a        1.082295   0.013710   78.94  2.6e-15 ***
---
Signif. codes:  0 ‘***’ 0.001 ‘**’ 0.01 ‘*’ 0.05 ‘.’ 0.1 ‘ ’ 1

Residual standard error: 0.005889 on 10 degrees of freedom

Number of iterations to convergence: 5 
Achieved convergence tolerance: 6.534e-07

フィッティング度合いの可視化

> concpre = seq(-10,-3.5, length=100)
> plot(theta~logIT,data=simulation,xlim=c(-10,-3.5),ylim=c(0,1))
> lines(concpre, predict(result2, newdata=list(logIT=concpre)))

あまり当て嵌まりが良くない。

2) 標準シグモイド関数 \(1/(1 + \exp(-x))\)

> sigmoid = function(x) 1/(1+exp(-x))
> result3 = nls(theta~1-sigmoid((logIT - logIC50)/a), data = simulation, start = c(logIC50=-6.5, a=1))
> summary(result3)

Formula: theta ~ 1 - sigmoid((logIT - logIC50)/a)

Parameters:
         Estimate Std. Error t value Pr(>|t|)    
logIC50 -6.476238   0.001243 -5209.7   <2e-16 ***
a        0.450384   0.001096   411.1   <2e-16 ***
---
Signif. codes:  0 ‘***’ 0.001 ‘**’ 0.01 ‘*’ 0.05 ‘.’ 0.1 ‘ ’ 1

Residual standard error: 0.001071 on 10 degrees of freedom

Number of iterations to convergence: 5 
Achieved convergence tolerance: 4.447e-07

シグモイド関数は完璧に当て嵌まっているように見える。なぜなら、下の線形回帰の節に示すようにθはロジット関数と関係があり、標準シグモイド関数はロジット関数の逆関数だから。

実験上はθ([3H]PDBu結合度)は大体0.2–0.8(20–80%)の範囲に収まるようにしているので、実際上は相補誤差関数を使っても結果に違いはほとんど出ないが、モデルとしては標準シグモイド関数の方が優れているので、こちらを使うべき。

線形回帰

次にフィッティングされたカーブの適合度を視覚的に判断するため、線形回帰を適用するため(Microsoft Excelが使える!)の線形グラフへの変換を示す.

\begin{equation}
\frac{\theta}{1-\theta} = \frac{\frac{[L]}{[L_0]}(K_{\rm d} + [L])}{\frac{K_{\rm d}}{K_{\rm i}}[I] + K_{\rm d} + [L] - \frac{[L]}{[L_0]}(K_{\rm d} + [L])}
\end{equation}

\([L_0] \simeq [L]\)が成り立つとすると,

\begin{equation}
\frac{\theta}{1-\theta} = \frac{K_{\rm d} + [L]}{\frac{K_{\rm d}}{K_{\rm i}}[I]}
\end{equation}

両辺の対数を取る(ここでは常用対数)と,freeのリガンド対数濃度 \(\log[I]\) に対して傾き\(-1\)の直線関係にとなる (ロジット関数) (図3)(※右辺の [L] も [I] の値によって変動する)。
\begin{equation}
\log \left(\frac{\theta}{1-\theta}\right) = -\log [I] -\log K_{\rm d} + \log K_{\rm i} + \log (K_{\rm d} + [L])
\end{equation}

 

図3.logistic関数 (\(\log_{10} \frac{p}{1 - p}\)) でfitting.縦軸は\(\log_{10} \frac{\theta}{1 - \theta}\),横軸はfreeのunlabelled ligandの濃度 \([I]\).総レセプター濃度 \([R_{\textrm T}]\) が小さくなる程,直線に近くなる.

上の図の横軸はlog[I](遊離の非標識リガンドの濃度)ですが、これを知ることはできないので、横軸を加えたリガンドの総濃度log[IT] に変えたプロットから計算したlog IC50は−6.4765となり、非線形回帰(標準シグモイド関数)から求めたlog IC50(-6.4762)と有効数字4桁まで一致しました(nM単位に変換するとそれぞれ333.8 nMおよび334.0 nM)。

結合度からKi値への簡易な変換

また, 結合阻害が50%を切らない程弱いリガンドについて、1点から\(K_{\rm i}\)を計算する方法として
\begin{equation}
\frac{\theta}{1-\theta} = \frac{K_{\rm d} + [L]}{\frac{K_{\rm d}}{K_{\rm i}}[I]}
\end{equation}
を変形すると、
\begin{equation}
K_{\rm i} = \left(\frac{\theta}{1-\theta}\right) \frac{K_{\rm d}[I]}{K_{\rm d} + [L]}
\end{equation}
レセプター濃度 \([R]\) に対して \([I]\) が十分大きければ(弱いリガンドなのでこれを満たす)、 \([I]\) はリガンド総濃度 \([I_{\textrm T}]\) で近似できるので
\begin{equation}
K_{\rm i} = \left(\frac{\theta}{1-\theta}\right) \frac{K_{\rm d}[I_{\rm T}]}{K_{\rm d} + [L]}
\end{equation}

Munson–Rodbard式

レセプター濃度 \([R]\) に対して \([I]\) が十分大きくない場合 (非標識リガンドの結合能が標識リガンドPDBuの結合と同等あるいはそれ以上の場合),\([I]\) をリガンド総濃度 \([I_{\rm T}]\) で近似できない.このような場合Munson–Rodbard式からIC50(総濃度)を使用して(\([I_{50}] \simeq \textrm{IC}_{50}\) の近似を使わずに)\(K_{\textrm i}\) を算出できる (Munson ad Rodbard, 1988; Huang, 2003).

\(y_0 = [RL_0]/[L_0]\) とすると,

\begin{equation}
K_{\rm i} = \frac{\textrm{IC}_{50}}{1+ \frac{[L_{\rm T}] (y_0 + 2)}{2 K_{\rm d} (y_0 + 1)} + y_0} - K_{\rm d} \left(\frac{y_0}{y_0 + 2}\right) \;\;\;\;\mbox{(Eq.26; Munson–Rodbard式) }
\end{equation}

\(y_0\)が非常に小さければ、上記の式はCheng–Prusoff式へと帰着する。

Munson–Rodbard式の導出

\(K_1 = 1/K_{\rm d}\), \(K_2 = 1/K_{\rm i}\) と定義する.
\begin{equation}
[RL] = K_1 [R] [L]\;\;\;\;\mbox{(Eq.27)}
\end{equation}
\begin{equation}
[RI] = K_2 [R] [I]\;\;\;\;\mbox{(Eq.28)}
\end{equation}
保存則から
\begin{equation}
[L_{\rm T}] = [RL] + [L]\;\;\;\;\mbox{(Eq.29)}
\end{equation}
\begin{equation}
[I_{\rm T}] = [RI] + [I]\;\;\;\;\mbox{(Eq.30)}
\end{equation}
\begin{equation}
[R_{\rm T}] = [RI] + [R] + [RL] = K_2 [R] [I] + [R] + K_1 [R] [L] = [R] (1+ K_1[L] + K_2 [I])\;\;\;\;\mbox{(Eq.31)}
\end{equation}

阻害剤が存在しない場合と50%阻害時の条件を考える.

阻害剤が存在しない場合の比を \([RL_0]/[L_0] = y_0\) と定義すると式29から,
\begin{equation}
[L_{\rm T}] = [L_0] (1 + y_0)\;\;\;\;\mbox{(Eq.32)}
\end{equation}
\begin{equation}
[L_0] =\frac{[L_{\rm T}]}{1 + y_0}\;\;\;\;\mbox{(Eq.33)}
\end{equation}
したがって,
\begin{equation}
[RL_0] = \frac{ y_0 [L_{\rm T}]}{1 + y_0}\;\;\;\;\mbox{(Eq.34)}
\end{equation}

50%阻害時は,
\begin{equation}
[RL_{50}] = \frac{ y_0 [L_{\rm T}]}{2 (1 + y_0)}\;\;\;\;\mbox{(Eq.35)}
\end{equation}
Eq.29から,
\begin{equation}
[L_{50}] = [L_{\rm T}] - [RL_{50}] = \frac{ [L_{\rm T}] (2 + y_0) }{2 (1 + y_0)}\;\;\;\;\mbox{(Eq.36)}
\end{equation}

Eq.27から50%阻害時のfreeのレセプターを求めると,
\begin{equation}
[R_{50}] = \frac{[RL_{50}]}{K_1 [L_{50}]} = \frac{y_0}{K_1 (y_0 + 2)}\;\;\;\;\mbox{(Eq.37)}
\end{equation}

Eq.28, 30から,
\begin{equation}
\textrm{IC}_{50} = [I_{{\rm T} 50}] = [RI_{50}] + [I_{50}] = [I_{50}](1+K_2 [R_{50}])\;\;\;\;\mbox{(Eq.38)}
\end{equation}
Eq.37をEq.38に代入すると,
\begin{equation}
[I_{50}] = \frac{\textrm{IC}_{50}}{1+\left(\frac{K_2}{K_1}\right)\left(\frac{y_0}{y_0+2}\right)}\;\;\;\;\mbox{(Eq.39)}
\end{equation}
Eq.31を \([R]\) について解いてEq.27に代入すると,
\begin{equation}
[RL] = \frac{K_1 [R_{\rm T}] [L] }{1+ K_1 [L] + K_2 [I]}\;\;\;\;\mbox{(Eq.40)}
\end{equation}

阻害剤が存在しない時,Eq.40はEq.34, 33から,
\begin{equation}
[R_{\rm T}] = y_0 \left(\frac{1}{K_1} + \frac{[L_{\rm T}]}{1 + y_0}\right)\;\;\;\;\mbox{(Eq.41)}
\end{equation}

50%阻害時,Eq.40は,
\begin{equation}
[RL_{50}] = \frac{K_1 [R_{\rm T}] [L_{50}] }{1+ K_1 [L_{50}] + K_2 [I_{50}]}\;\;\;\;\mbox{(Eq.42)}
\end{equation}

Eq.42を\(1/K_2\)について解く。

\begin{equation} \frac{1}{K_2} = \frac{[I_{50}]}{\frac{K_1[R_{T}][L_{50}]}{[RL_{50}]} - K_1[L_{50}] - 1} \end{equation}

Eq.39から \([I_{50}]\)を代入して整理する。

\begin{equation} \frac{1}{K_2} + \frac{1}{K_1}\left(\frac{y_0}{y_0+2}\right) = \frac{\mathrm{IC}_{50}}{\frac{K_1[R_{T}][L_{50}]}{[RL_{50}]} - K_1[L_{50}] - 1} \end{equation}

上の式の右辺の分母に、Eq.36から\([L_{50}]\)、Eq.41から \([R_{\rm T}]\)、そして \(\frac{[L_{50}]}{[RL_{50}]} = \frac{y_0+2}{y_0} \) を代入すると、

\begin{equation} \mbox{右辺の分母} = K_1 \times y_0\left(\frac{1}{K_1} + \frac{[L_\mathrm{T}]}{y_0+1}\right) \times \frac{y_0+2}{y_0} - K_1\frac{[L_\mathrm{T}](y_0+2)}{2(y_0+1)} - 1 \end{equation}

\begin{equation} = 2+ y_0 + K_1\frac{[L_\mathrm{T}](y_0+2)}{y_0+1} - K_1\frac{[L_\mathrm{T}](y_0+2)}{2(y_0+1)} - 1 \end{equation}

\begin{equation} = 1+ K_1\frac{[L_\mathrm{T}](y_0+2)}{2(y_0+1)} + y_0 \end{equation}

したがって、
\begin{equation}
\frac{1}{K_2} = \frac{\textrm{IC}_{50}}{1+ \frac{[L_{\rm T}] (y_0 + 2)}{2 \left(\frac{1}{K_1}\right) (y_0 + 1)} + y_0} - \left(\frac{1}{K_1}\right) \left(\frac{y_0}{y_0 + 2}\right)\;\;\;\;\mbox{(Eq.43)}
\end{equation}

最後に\(1/K_2 = K_{\rm i}\), \(1/K_1 = K_{\rm d}\)を戻すとEq.26となる.

Dandlikerの式

阻害実験のそれぞれのデータ点から\(K_{\rm i}\)を算出できる (Dandliker, 1981).

\(\chi = [RL]/[L]\) とする (\([L]\)の値は \([L] = [L_{\rm T}] - [RL]\) と計算) と,

\begin{equation}
K_i = \frac{[I_{\rm T}] K_d \chi}{[R_{\rm T}] - \frac{[L_{\rm T}]\chi}{1 + \chi} - K_d \chi} - K_d \chi\;\;\;\;\mbox{(Eq.44)}
\end{equation}

また,\(f_b = [RL]/[L_{\rm T}]\) とすると,\(\chi = f_b/(1-f_b)\) なので,

\begin{equation}
K_{\rm i} = \frac{[I_{\rm T}] K_{\rm d} f_b}{[R_{\rm T}](1 - f_b) - K_{\rm d} f_b - [L_{\rm T}] f_b (1 - f_b)} - \frac{K_{\rm d} f_b}{ 1 - f_b}\;\;\;\;\mbox{(Eq.45)}
\end{equation}

Eq.45はHuang, 2003の式 (11) を変形したものです.

Dandlikerの式の導出

先程と同様に,\(K_1 = 1/K_{\rm d}\), \(K_2 = 1/K_{\rm i}\)と定義する.
\begin{equation}
\chi = \frac{[RL]}{[L]} = K_1 ([R_{\rm T}] - [RL] - [RI])\;\;\;\;\mbox{(Eq.46)}
\end{equation}
\begin{equation}
\frac{[RI]}{[I]} = K_2 ([R_{\rm T}] - [RL] - [RI])\;\;\;\;\mbox{(Eq.47)}
\end{equation}
\begin{equation}
[L_{\rm T}] = [RL] + [L]\;\;\;\;\mbox{(Eq.48)}
\end{equation}
\begin{equation}
[I_{\rm T}] = [RI] + [I]\;\;\;\;\mbox{(Eq.49)}
\end{equation}
\begin{equation}
[RL] =\frac{[L_{\rm T}]\chi}{1 + \chi}\;\;\;\;\mbox{(Eq.50)}
\end{equation}
\begin{equation}
[L] =\frac{[L_{\rm T}]}{1 + \chi}\;\;\;\;\mbox{(Eq.51)}
\end{equation}
Eq.46から,
\begin{equation}
[RI] = [R_{\rm T}] - [RL] - \frac{\chi}{K_1} = [R_{\rm T}] - \frac{[L_{\rm T}]\chi}{1 + \chi} - \frac{\chi}{K_1}\;\;\;\;\mbox{(Eq.52)}
\end{equation}

Eq.47を \([I]\) について解くと
\begin{equation}
[I] = \frac{[RI]}{K_2} \times \frac{1}{[R_{\rm T}] - [RL] - [RI]}\;\;\;\;\mbox{(Eq.53)}
\end{equation}
\([RI] = [R_{\rm T}] - [RL] - \frac{\chi}{K_1}\)なので,
\begin{equation}
[I] = \frac{[R_{\rm T}] - [RL] - \frac{\chi}{K_1}}{K_2} \times \frac{1}{\frac{\chi}{K_1}} = \frac{K_1}{K_2\chi}\left([R_{\rm T}] - \frac{[L_{\rm T}]\chi}{1 + \chi} - \frac{\chi}{K_1}\right)\;\;\;\;\mbox{(Eq.54)}
\end{equation}
Eq.52とEq.54をEq.49に代入すると,
\begin{equation}
[I_{\rm T}] = \left(1 + \frac{K_1}{K_2\chi}\right) \left([R_{\rm T}] - \frac{[L_{\rm T}]\chi}{1 + \chi} - \frac{\chi}{K_1}\right)\;\;\;\;\mbox{(Eq.55)}
\end{equation}

Eq.55を\(1/K_2\)について解くと,
\begin{equation}
K_i = \frac{1}{K_2} = \frac{[I_{\rm T}] K_d \chi}{[R_{\rm T}] - \frac{[L_{\rm T}]\chi}{1 + \chi} - K_d \chi} - K_d \chi\;\;\;\;\mbox{(Eq.56)}
\end{equation}

Excelでinhibition curveの図を描く方法

\([RL]/[RL_0]\) を求める.\([L_0] = [L_{\rm T}] - [RL_0]\) とする.また,\([R_0] = [R_{\rm T}] - [RL_0]\).

したがって,Eq.3から
\begin{equation}
K_{\rm d} = \frac{([R_{\rm T}] - [RL_0])([L_{\rm T}] - [RL_0])}{[RL_0]}
\end{equation}
変形して,
\begin{equation}
[RL_0]^2 -([R_{\rm T}] + [L_{\rm T}] + K_{\rm d})[RL_0] + [R_{\rm T}][L_{\rm T}] = 0
\end{equation}
\begin{equation}
[RL_0] = \frac{1}{2}\left[([R_{\rm T}] + [L_{\rm T}] + K_{\rm d}) - \sqrt{([R_{\rm T}] + [L_{\rm T}] + K_{\rm d})^2 - 4[R_{\rm T}][L_{\rm T}]}\right]
\end{equation}

\([RL]\)はEq.13から
\begin{equation}
[RL] = \frac{[R_{\rm T}]([L_{\rm T}]-[RL])}{\left(1+\frac{[I]}{K_{\rm i}}\right)K_{\rm d} + ([L_{\rm T}]-[RL])}
\end{equation}

変形して,
\begin{equation}
[RL]^2 -\left[[R_{\rm T}] + [L_{\rm T}] + \left(1+\frac{[I]}{K_{\rm i}}\right)K_{\rm d}\right][RL] + [R_{\rm T}][L_{\rm T}] = 0
\end{equation}
\begin{equation}
[RL] = \frac{1}{2}\left\{\left[[R_{\rm T}] + [L_{\rm T}] + \left(1+\frac{[I]}{K_{\rm i}}\right)K_{\rm d}\right] - \sqrt{\left[[R_{\rm T}] + [L_{\rm T}] + \left(1+\frac{[I]}{K_{\rm i}}\right)K_{\rm d}\right]^2 - 4[R_{\rm T}][L_{\rm T}]}\right\}
\end{equation}

阻害リガンド濃度がレセプター濃度より十分大きい場合は,\([I]\) をリガンド総濃度 \([I_{\rm T}]\) で近似できる.

References

  • Sharkey, N. A.; Blumberg, P. M. Highly lipophilic phorbol esters as inhibitors of specific [3H]phorbol 12,13-dibutyrate binding. Cancer Res. 1985, 45, 19–24. [URL] [PMID]: 3855281.
  • Dandliker, W. B.; Hsu, M.-L.; Levin, J.; Rao, R. Equilibrium and kinetic inhibition assays based upon fluorescence polarization. Methods Enzymol. 1981, 74, 3–28. DOI: 10.1016/0076-6879(81)74003-5. PMID: 7321886.
  • Goldstein, A.; Barrett, R. W. Ligand dissociation constants from competition binding assays: errors associated with ligand depletion. Mol. Pharmacol. 1987, 31, 603–609. [URL] PMID: 3600604.
  • Hulme, X. C.; Trevethick, M. A. Ligand binding assays at equilibrium: validation and interpretation. Br. J. Pharmacol. 2010, 161, 1219–1237. DOI: 10.1111/j.1476-5381.2009.00604. PMID: 20132208.
  • Huang, X. Equilibrium competition binding assay: inhibition mechanism from a single dose response. J. Ther. Biol. 2003, 225, 369–376. DOI: 10.1016/S0022-5193(03)00265-0. PMID: 14604589.
  • Munson, P. J.; Rodbard, D. An exact correction to the Cheng-Prusoff correction. J. Receptor Res. 1988, 8, 533–546. DOI: 10.3109/10799898809049010. PMID: 3385692.

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